Agentes etiológicos e principais métodos para detecção do M. leprae.
por Patrícia D. Deps,
João Marcelo Antunes,
e Simon M. Collin.
Agentes etiológicos
O M. leprae é um bacilo imóvel, não cultivável em meios artificiais, levemente encurvado, álcool-ácido resistente (BAAR), intracelular obrigatório, apresentando afinidade por células cutâneas (macrófagos) e dos nervos periféricos (células de Schwann). Sua parede celular é composta de um complexo covalente ligado ao peptidoglicano-arabinogalactano-ácido micólico, bastante semelhante ao existente nas paredes celulares de outras micobactérias.1 O glicolipídio-fenólico-1 (PGL-1), predominante na parede celular, é um glicolipídio que confere a capacidade imunogênica mais marcante do M. leprae e pode estar envolvido na interação com a laminina da célula de Schwann.
Embora o M. leprae não cresça em meio de cultura, o bacilo se multiplica no coxim da pata do camundongo e em tatus reproduzindo um quadro semelhante às formas contagiantes da hanseníase.2
Em 2008, foi identificada no México uma nova espécie de micobactéria, denominada Mycobacterium lepromatosis, como causa de hanseníase virchowiana difusa.3 Posteriormente, o mesmo foi detectado na Africa, Ásia, e no Brasil.4
Por análise genômica comparativa foi demonstrado que o M. lepromatosis parece ser mais antigo na escala evolutiva quando comparado com M. leprae.5
Métodos utilizados na rotina propedêutica da hanseníase
Baciloscopia
A baciloscopia é um exame laboratorial que fornece informações sobre a presença do bacilo de Hansen no organismo de um paciente com suspeita de hanseníase. Através de um exame microscópico, tenta-se detectar o bacilo em raspados intradérmicos das lesões dermatológicas ou áreas anestésicas, se houver, dos lóbulos auriculares e dos cotovelos.6,7
O índice baciloscópico proposto por Ridley, representa a escala logarítmica com avaliação quantitativa. De acordo com o número de bacilos encontrados nos esfregaços de linfa retirada de quatro sítios cutâneos, o índice baciloscópico foi padronizado sendo o resultado positivo apresentado em número de cruzes (+) e adotado pelo Ministério da Saúde desde 1989 (Tabela 1).
Tabela 1 – Índice baciloscópico: critérios de classificação adotados pelo Ministério da Saúde.
Histopatologia
As diferentes respostas imunológicas do hospedeiro determinam as diferentes formas clínicas e histopatológicas do espectro da hanseníase. As colorações utilizadas são: hematoxilina e eosina, e as colorações específicas para BAAR, Ziehl-Neelsen, Wade ou Fite-Faraco.6 As lâminas são observadas utilizando um microscópio óptico.
Pelo método de Ziehl-Neelsen (Figura 1), Wade e Fite-Faraco, os bacilos apresentam-se corados uniformemente em vermelho e, quando viáveis, em forma de bastonetes, isolados ou agrupados, formando globias que são características do M. leprae.8 Essas colorações são amplamente utilizadas para a identificação dos bacilos em tecidos, principalmente em fragmentos de pele. A técnica de imunohistoquímica com marcador BCG (Figura 2) também pode ser utilizada para identificação do M. leprae sendo o bacilo visualizado na coloração marrom dourada. Resultados falsos positivos podem ocorrer com esses métodos por identificação de bactérias Gram positivas, mastócitos e melanófagos pelos mesmos corantes.9,10
A classificação Ridley-Jopling foi desenvolvida para pesquisas científicas, mas é utilizada na prática clínica em muitas partes do mundo.11,12 O sistema Ridley-Jopling classifica a hanseníase como uma doença imunomediada com hanseníase tuberculoide (TT) em uma extremidade do espectro da doença e a hanseníase virchowiana (VV) na outra. A forma TT se correlaciona imunologicamente com a imunidade celular mediada (IMC) forte, enquanto a forma VV se correlaciona com o IMC fraco. Entre estas duas extremidades encontra-se o espectro clinicamente instável, subdividido em dimorfa-tuberculoide (DT), dimorfa-dimorfa (DD), e dimorfa-virchowiana (DV). A seguir, aspectos histopatológicos das formas clínico-imunológicas:
Hanseníase tuberculoide (TT) apresenta granulomas com ou sem células gigantes de Langhans, nervos danificados e infiltrados pelo processo inflamatório, as células epitelióides dispõem-se lado a lado. Raros bacilos, demonstrando uma fagocitose completa, e quando ocorrem estão quase que exclusivamente em ramos nervosos.
Hanseníase dimorfa-tuberculoide (DT) apresenta-se semelhante ao TT, mas com ocasionais bacilos, usualmente em nervos, pode ocorrer zona poupada de processo inflamatório na região subepidérmica.
Hanseníase dimorfa-dimorfa (DD) apresenta células epitelióides, histiócitos, linfócitos focais, aumento de celularidade nos nervos, presença de bacilos localizados nos nervos e zona subepidérmica poupada.
Hanseníase dimorfa-virchowiana (DV) apresenta histiócitos, poucas células epitelióides, células espumosas ou de Virchow (macrófagos ou histiócitos contendo grande número de bacilos), presença de bacilos nos nervos, e zona subepidérmica poupada.
Hanseníase virchowiana é constituída por granuloma do tipo histio-monocitário. Presença de células de Virchow. O quadro é composto ainda por poucos linfócitos, numerosos bacilos nos nervos, mínima infiltração celular intraneural, e zona subepidérmica poupada.
Hanseníase indeterminada apresenta infiltrado inflamatório não específico, constituído de linfócitos e histiócitos não diferenciados, ao redor dos nervos e apêndices cutâneos. Raros bacilos.
Métodos sorológicos
Técnicas sorológicas como o ELISA e de fluxo lateral (ML Flow) detectam a presença de anticorpos da classe IgM anti-PGL-1.13 A molécula do PGL-I é composta pelo trissacarídio 3,6-di-O-metil-beta-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3-di-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil-(1-2)-3-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil.14 A remoção do açúcar terminal resulta em perda da ligação da maioria dos anticorpos, enquanto que a remoção da cadeia longa de ácidos graxos da molécula do PGL-I não produz efeito na ligação dos anticorpos.
Esta informação sugere que a síntese química da última parte do dissacarídio produz um epítopo que estimula a produção de anticorpos monoclonais, empregados na detecção da presença do PGL-I.15 A síntese de açúcares (natural di- ou trissacarídeos, ND ou NT, respectivamente), seguida à identificação do açúcar terminal como o antígeno primário determinante do PGL-I e a sua ligação à albumina de soro bovino (“bovine serum albumine”, BSA) com um anel octila (O), ou um anel fenólico (P), pode produzir antígenos semi-sintéticos.16 O antígeno ND-O-BSA foi considerado igual ou melhor do que os outros derivados do antígeno PGL-I, tanto os naturais, quanto os sintéticos.17
A potente resposta imunológica ao PGL-1, com produção de IgM, é proporcional à carga bacilar,18 e é espécie específico.19
LID-1 é uma fusão de duas proteínas M. leprae (ML0405 and ML2331) para detectar anticorpos IgG,20 enquanto NDO-LID combina LID-1 com um mimetopo sintético PGL-1 IgM.21Já o rMLP15 é um polipéptido recombinante purificado de seis proteínas (ML1358, ML2055, ML0885, ML1811, ML1812, e ML1214).22
As revisões sistemáticas têm sido incapazes de identificar uma técnica sorológica com desempenho conclusivamente superior em termos de sensibilidade e especificidade, devido à heterogeneidade entre os estudos, mas todas as técnicas sorológicas têm desempenho deficiente na detecção da hanseníase paucibacilar.23–25
A tabela 2 demonstra os antígenos e algumas de suas características utilizadas nas técnicas sorológicas.
Tabela 2 - Antígenos utilizados no diagnóstico da hanseníase
Métodos genômicos
Importante avanço para o entendimento da biologia do M. leprae foi a obtenção do sequenciamento do seu genoma, o qual tem menor conteúdo de Guanina e Citosina comparado ao encontrado no M. tuberculosis.26 Possui aproximadamente 4.000 genes que codificam proteínas, 27% são de genes degenerados (pseudogenes) e 2% é composto por seqüências repetitivas.
Após o sequenciamento do genoma do M. leprae, começaram pesquisas a fim de encontrar as sequências repetitivas no genoma, número variável repetições em tandem (VNTRs) e Short Tandem Repeats (STRs),27 e polimorfismos de base única (SNPs) com o objetivo de diferenciar cepas desta bactéria. Estas técnicas tem sido utilizados com intuito de compreender a diversidade genética deste patógeno, bem como elucidar aspectos referentes à disseminação e lacunas epidemiológicas da hanseníase.28
Inicialmente, estas análises revelaram apenas quatro SNPs (SNP tipos 1, 2, 3 e 4).29 No entanto, abordagens mais recentes, envolvendo 78 SNPs informativos, permitiram classificar o M. leprae em 16 subtipos, para os quais também foi possível fazer uma correlação entre a origem geográfica do hanseniano e o perfil de SNP.30
PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas derivações foram desenvolvidas para auxiliar no diagnóstico da hanseníase.31,32
Diferentes sequências foram utilizadas como alvos para a PCR. São estudados os genes que codificam o antígeno de 36-kDa, o antígeno de 18-kDa, o antígeno de 65-kDa, complexo 85, 16S rDNA, hsp65 (heat shock protein 65) e a sequência repetitiva RLEP. As técnicas de PCR em tempo Real (qPCR) melhoraram a sensibilidade e especificidade na detecção do M. leprae.33
Embora a PCR seja potencialmente útil no diagnóstico de casos difíceis como hanseníase neural pura, hanseníase paucibacilar e pacientes com apresentação clínica atípica, PCR não é utilizada na prática clínica de rotina.33,34
Da mesma forma, técnicas genômicas como o seqüenciamento de próxima geração (NGS) sejam úteis na pesquisa científica, é pouco provável que tenham utilidade clínica em cenários endêmicos de hanseníase.35
A tabela 3 demonstra os marcadores e algumas de suas características utilizadas nas técnicas da PCR.
Tabela 3 - Marcadores utilizados na detecção do DNA do M. leprae
Génèse Faïrana Godeline Essali,
Júlia Salarini Carneiro e
Lavínia Damacena Perin
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