Agentes etiológicos e principais métodos para detecção do M. leprae.

por Patrícia D. Deps,

Departmento de Medicina Social, Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil

João Marcelo Antunes,

Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Hospital Veterinário Jerônimo Dix-Huit Rosado Maia, Mossoró, Rio Grande do Norte, Brasil.

e Simon M. Collin.

Public Health England, Londres. Reino Unido.

Agentes etiológicos

O M. leprae é um bacilo imóvel, não cultivável em meios artificiais, levemente encurvado, álcool-ácido resistente (BAAR), intracelular obrigatório, apresentando afinidade por células cutâneas (macrófagos) e dos nervos periféricos (células de Schwann). Sua parede celular é composta de um complexo covalente ligado ao peptidoglicano-arabinogalactano-ácido micólico, bastante semelhante ao existente nas paredes celulares de outras micobactérias.¹ O glicolipídio-fenólico-1 (PGL-1), predominante na parede celular, é um glicolipídio que confere a capacidade imunogênica mais marcante do M. leprae e pode estar envolvido na interação com a laminina da célula de Schwann.

Embora o M. leprae não cresça em meio de cultura, o bacilo se multiplica no coxim da pata do camundongo e em tatus reproduzindo um quadro semelhante às formas contagiantes da hanseníase.²

Em 2008, foi identificada no México uma nova espécie de micobactéria, denominada Mycobacterium lepromatosis, como causa de hanseníase virchowiana difusa.³ Posteriormente, o mesmo foi detectado na Africa, Ásia, e no Brasil.⁴

Por análise genômica comparativa foi demonstrado que o M. lepromatosis parece ser mais antigo na escala evolutiva quando comparado com M. leprae.⁵

Métodos utilizados na rotina propedêutica da hanseníase

Baciloscopia

A baciloscopia é um exame laboratorial que fornece informações sobre a presença do bacilo de Hansen no organismo de um paciente com suspeita de hanseníase. Através de um exame microscópico, tenta-se detectar o bacilo em raspados intradérmicos das lesões dermatológicas ou áreas anestésicas, se houver, dos lóbulos auriculares e dos cotovelos.^6,7

O índice baciloscópico proposto por Ridley, representa a escala logarítmica com avaliação quantitativa. De acordo com o número de bacilos encontrados nos esfregaços de linfa retirada de quatro sítios cutâneos, o índice baciloscópico foi padronizado sendo o resultado positivo apresentado em número de cruzes (+) e adotado pelo Ministério da Saúde desde 1989 (Tabela 1).

Tabela 1 – Índice baciloscópico: critérios de classificação adotados pelo Ministério da Saúde.

Histopatologia

As diferentes respostas imunológicas do hospedeiro determinam as diferentes formas clínicas e histopatológicas do espectro da hanseníase. As colorações utilizadas são: hematoxilina e eosina, e as colorações específicas para BAAR, Ziehl-Neelsen, Wade ou Fite-Faraco.⁶ As lâminas são observadas utilizando um microscópio óptico.

Pelo método de Ziehl-Neelsen (Figura 1), Wade e Fite-Faraco, os bacilos apresentam-se corados uniformemente em vermelho e, quando viáveis, em forma de bastonetes, isolados ou agrupados, formando globias que são características do M. leprae.⁸ Essas colorações são amplamente utilizadas para a identificação dos bacilos em tecidos, principalmente em fragmentos de pele. A técnica de imunohistoquímica com marcador BCG (Figura 2) também pode ser utilizada para identificação do M. leprae sendo o bacilo visualizado na coloração marrom dourada. Resultados falsos positivos podem ocorrer com esses métodos por identificação de bactérias Gram positivas, mastócitos e melanófagos pelos mesmos corantes.^9,10

Figura 1. Aspectos morfológicos do Mycobacterium leprae utilizando o método de Ziehl-Neelsen num paciente com hanseníase virchowiana. Objetiva de 100x.

A classificação Ridley-Jopling foi desenvolvida para pesquisas científicas, mas é utilizada na prática clínica em muitas partes do mundo.^11,12 O sistema Ridley-Jopling classifica a hanseníase como uma doença imunomediada com hanseníase tuberculoide (TT) em uma extremidade do espectro da doença e a hanseníase virchowiana (VV) na outra. A forma TT se correlaciona imunologicamente com a imunidade celular mediada (IMC) forte, enquanto a forma VV se correlaciona com o IMC fraco. Entre estas duas extremidades encontra-se o espectro clinicamente instável, subdividido em dimorfa-tuberculoide (DT), dimorfa-dimorfa (DD), e dimorfa-virchowiana (DV). A seguir, aspectos histopatológicos das formas clínico-imunológicas:

Figura 2. Imunoexpressão do antígeno BCG em portador de hanseníase virchowiana (controle positivo). Objetiva de 40x.

Hanseníase tuberculoide (TT) apresenta granulomas com ou sem células gigantes de Langhans, nervos danificados e infiltrados pelo processo inflamatório, as células epitelióides dispõem-se lado a lado. Raros bacilos, demonstrando uma fagocitose completa, e quando ocorrem estão quase que exclusivamente em ramos nervosos.

Hanseníase dimorfa-tuberculoide (DT) apresenta-se semelhante ao TT, mas com ocasionais bacilos, usualmente em nervos, pode ocorrer zona poupada de processo inflamatório na região subepidérmica.

Hanseníase dimorfa-dimorfa (DD) apresenta células epitelióides, histiócitos, linfócitos focais, aumento de celularidade nos nervos, presença de bacilos localizados nos nervos e zona subepidérmica poupada.

Hanseníase dimorfa-virchowiana (DV) apresenta histiócitos, poucas células epitelióides, células espumosas ou de Virchow (macrófagos ou histiócitos contendo grande número de bacilos), presença de bacilos nos nervos, e zona subepidérmica poupada.

Hanseníase virchowiana é constituída por granuloma do tipo histio-monocitário. Presença de células de Virchow. O quadro é composto ainda por poucos linfócitos, numerosos bacilos nos nervos, mínima infiltração celular intraneural, e zona subepidérmica poupada.

Hanseníase indeterminada apresenta infiltrado inflamatório não específico, constituído de linfócitos e histiócitos não diferenciados, ao redor dos nervos e apêndices cutâneos. Raros bacilos.

Métodos sorológicos

Técnicas sorológicas como o ELISA e de fluxo lateral (ML Flow) detectam a presença de anticorpos da classe IgM anti-PGL-1.¹³ A molécula do PGL-I é composta pelo trissacarídio 3,6-di-O-metil-beta-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3-di-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil-(1-2)-3-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil.¹⁴ A remoção do açúcar terminal resulta em perda da ligação da maioria dos anticorpos, enquanto que a remoção da cadeia longa de ácidos graxos da molécula do PGL-I não produz efeito na ligação dos anticorpos.

Esta informação sugere que a síntese química da última parte do dissacarídio produz um epítopo que estimula a produção de anticorpos monoclonais, empregados na detecção da presença do PGL-I.¹⁵ A síntese de açúcares (natural di- ou trissacarídeos, ND ou NT, respectivamente), seguida à identificação do açúcar terminal como o antígeno primário determinante do PGL-I e a sua ligação à albumina de soro bovino (“bovine serum albumine”, BSA) com um anel octila (O), ou um anel fenólico (P), pode produzir antígenos semi-sintéticos.¹⁶ O antígeno ND-O-BSA foi considerado igual ou melhor do que os outros derivados do antígeno PGL-I, tanto os naturais, quanto os sintéticos.¹⁷

A potente resposta imunológica ao PGL-1, com produção de IgM, é proporcional à carga bacilar,¹⁸ e é espécie específico.¹⁹

LID-1 é uma fusão de duas proteínas M. leprae (ML0405 and ML2331) para detectar anticorpos IgG,²⁰ enquanto NDO-LID combina LID-1 com um mimetopo sintético PGL-1 IgM.²¹Já o rMLP15 é um polipéptido recombinante purificado de seis proteínas (ML1358, ML2055, ML0885, ML1811, ML1812, e ML1214).²²

As revisões sistemáticas têm sido incapazes de identificar uma técnica sorológica com desempenho conclusivamente superior em termos de sensibilidade e especificidade, devido à heterogeneidade entre os estudos, mas todas as técnicas sorológicas têm desempenho deficiente na detecção da hanseníase paucibacilar.^23–25

A tabela 2 demonstra os antígenos e algumas de suas características utilizadas nas técnicas sorológicas.

Tabela 2 - Antígenos utilizados no diagnóstico da hanseníase

Métodos genômicos

Importante avanço para o entendimento da biologia do M. leprae foi a obtenção do sequenciamento do seu genoma, o qual tem menor conteúdo de Guanina e Citosina comparado ao encontrado no M. tuberculosis.²⁶ Possui aproximadamente 4.000 genes que codificam proteínas, 27% são de genes degenerados (pseudogenes) e 2% é composto por seqüências repetitivas.

Após o sequenciamento do genoma do M. leprae, começaram pesquisas a fim de encontrar as sequências repetitivas no genoma, número variável repetições em tandem (VNTRs) e Short Tandem Repeats (STRs),²⁷ e polimorfismos de base única (SNPs) com o objetivo de diferenciar cepas desta bactéria. Estas técnicas tem sido utilizados com intuito de compreender a diversidade genética deste patógeno, bem como elucidar aspectos referentes à disseminação e lacunas epidemiológicas da hanseníase.²⁸

Inicialmente, estas análises revelaram apenas quatro SNPs (SNP tipos 1, 2, 3 e 4).²⁹ No entanto, abordagens mais recentes, envolvendo 78 SNPs informativos, permitiram classificar o M. leprae em 16 subtipos, para os quais também foi possível fazer uma correlação entre a origem geográfica do hanseniano e o perfil de SNP.³⁰

PCR

A reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas derivações foram desenvolvidas para auxiliar no diagnóstico da hanseníase.^31,32

Diferentes sequências foram utilizadas como alvos para a PCR. São estudados os genes que codificam o antígeno de 36-kDa, o antígeno de 18-kDa, o antígeno de 65-kDa, complexo 85, 16S rDNA, hsp65 (heat shock protein 65) e a sequência repetitiva RLEP. As técnicas de PCR em tempo Real (qPCR) melhoraram a sensibilidade e especificidade na detecção do M. leprae.³³

Embora a PCR seja potencialmente útil no diagnóstico de casos difíceis como hanseníase neural pura, hanseníase paucibacilar e pacientes com apresentação clínica atípica, PCR não é utilizada na prática clínica de rotina.^33,34

Da mesma forma, técnicas genômicas como o seqüenciamento de próxima geração (NGS) sejam úteis na pesquisa científica, é pouco provável que tenham utilidade clínica em cenários endêmicos de hanseníase.³⁵

A tabela 3 demonstra os marcadores e algumas de suas características utilizadas nas técnicas da PCR.

Tabela 3 - Marcadores utilizados na detecção do DNA do M. leprae

Legenda: Real Time-PCR (qPCR); Sensibilidade (S); Especificidade (E); MB (Multibacilar); PB (Paucibacilar)

Colaboradores acadêmicos

Génèse Faïrana Godeline Essali,

Júlia Salarini Carneiro e

Lavínia Damacena Perin

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