NAT-HANS: o primeiro teste baseado em PCR com boas pråticas de fabricação para diagnóstico da hanseníase.

por Milton Moraes.

Chefe do LaboratĂłrio de HansenĂ­ase da IOC-FIOCRUZ.
19/08/2021
Foto: Milton Moraes

AtĂ© hoje, nĂŁo hĂĄ testes diagnĂłsticos de hansenĂ­ase considerados padrĂŁo-ouro. Testes para detecção indireta da doença, como anĂĄlises sorolĂłgicas para identificação de anticorpos produzidos contra componentes do Mycobacterium leprae, foram desenvolvidos1. Uma frequĂȘncia de 20-30% Ă© observada em indivĂ­duos saudĂĄveis e a taxa de falsos negativos (pacientes paucibacilares que nĂŁo apresentam anticorpos) sugere que esses testes, tal como desenvolvidos, nĂŁo sĂŁo adequados Ă  utilização para diagnĂłstico2. AnĂĄlises celulares sĂŁo capazes de observar o aumento de secreção de citocinas, como interferon-gama, em culturas de cĂ©lulas do sangue estimuladas com proteĂ­nas do M. leprae3. Essas tĂ©cnicas sĂŁo promissoras, mas ainda estĂŁo em fase de desenvolvimento. Metodologias mais laboriosas e que dependem de maior treinamento e infraestrutura, como a revelação de assinaturas moleculares especĂ­ficas dos indivĂ­duos doentes por meio da detecção de RNAm por PCR em tempo real (PCR-RT), estĂŁo avançando rapidamente4. O maior problema de todos esses mĂ©todos Ă© a falta de estudos controlados e multicĂȘntricos e o controle de qualidade dos reagentes com boas prĂĄticas de fabricação, o que leva Ă  ausĂȘncia de reprodutibilidade dos resultados.

A investigação direta do patĂłgeno Ă© uma alternativa, e, classicamente, a detecção por baciloscopia tambĂ©m carece de sensibilidade, embora seja utilizada devido Ă  facilidade de execução do mĂ©todo. Ao longo dos Ășltimos 30 anos, o LaboratĂłrio de HansenĂ­ase foi pioneiro, no Brasil, quando da introdução da tĂ©cnica de detecção do DNA de Mycobacterium leprae por PCR para o diagnĂłstico da doença, com o trabalho de Adalberto Santos5. Posteriormente, nosso grupo aprimorou o mĂ©todo a partir da tĂ©cnica de PCR-RT. E, apĂłs 15 anos desde a publicação do primeiro artigo sobre o tema6, conseguimos finalizar o teste diagnĂłstico com boas prĂĄticas de fabricação, aprovado junto Ă  AgĂȘncia de VigilĂąncia SanitĂĄria (ANVISA) em uma parceria entre o LaboratĂłrio de HansenĂ­ase do Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto de Biologia Molecular do ParanĂĄ (IBMP), ambos da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). O artigo de 20066 e posteriormente o artigo de 20117, ambos de autoria principal de Alejandra Martinez, entĂŁo doutoranda do LaboratĂłrio de HansenĂ­ase, testaram diferentes regiĂ”es do genoma (alvos), indicando sensibilidade e especificidade de cada um deles. O PCR-RT, dada a diminuição da manipulação das amostras, e, tambĂ©m, a possibilidade de semi-automação com a eliminação de etapas laboriosas de processamento e avaliação dos resultados, permitiu o aumento da escala para as anĂĄlises.

O LaboratĂłrio de HansenĂ­ase Ă© centro de referĂȘncia junto ao MinistĂ©rio da SaĂșde do Brasil e hospeda um ambulatĂłrio para diagnĂłstico, tratamento de pacientes e seus contatos domiciliares. A partir desses artigos seminais, estabeleceu-se, em projetos, uma rotina para acompanhamento de casos de diagnĂłstico difĂ­cil, tais quais os paucibacilares, e acompanhamento de contatos. Nesse perĂ­odo, o teste para pesquisa foi estruturado e o controle de qualidade interno foi definido com procedimentos operacionais padrĂŁo desenvolvidos por Suelen Moreira. Posteriormente, estudos do doutoramento de Raquel Barbieri demonstraram que nesses casos difĂ­ceis, em contraste com outras doenças dermatolĂłgicas, o PCR quantitativo (qPCR) aumenta a sensibilidade (57% para o qPCR), quando comparado com a histopatologia (35%)8. O estudo posterior para acompanhamento de contatos, chefiado por Fernanda Manta, confirmou a validade do exame molecular para diagnĂłstico da doença quando lesĂ”es suspeitas eram identificadas nesse grupo de contatos domiciliares dos pacientes. Entretanto, a positividade da qPCR em contato domiciliares saudĂĄveis (sem lesĂ”es) nĂŁo Ă© um bom preditor de adoecimento9. Portanto, com esses dados, aperfeiçoamos o teste, com reagentes produzidos com boas prĂĄticas de fabricação pelos nossos parceiros do IBMP. Fernanda Manta juntamente com Alexandre Costa e Thiago Jacomasso do IBMP capitanearam os estudos de reprodutibilidade, estabilidade, repetibilidade, especificidade e sensibilidade, nos quais amostras clĂ­nicas de biĂłpsias de pele foram utilizadas. Esse trabalho resultou em um dossiĂȘ submetido Ă  ANVISA, que aprovou a solicitação do teste para ser usado em biĂłpsias de pele de pessoas com lesĂ”es suspeitas de hansenĂ­ase e estĂĄ compilado em um artigo submetido Ă  publicação. O teste deve ser utilizado na rede de LACENs (LaboratĂłrios Centrais dos Estados) com o apoio do MinistĂ©rio da SaĂșde. Ainda, projetos que avaliam outras amostras clĂ­nicas, a exemplo de sangue e raspado dĂ©rmico, bem como variaçÔes tĂ©cnicas na extração do DNA para aumento da sensibilidade e precisĂŁo do teste estĂŁo em andamento. A expectativa Ă© que a chegada do teste Ă  rede do Sistema Único de SaĂșde possa aumentar a precisĂŁo e a sensibilidade das anĂĄlises, evitando diagnĂłsticos tardios. Com isso, espera-se diminuir incapacidades e o diagnĂłstico de formas difĂ­ceis, o que possibilitarĂĄ a interrupção da cadeia de transmissĂŁo que culmine com uma redução importante na incidĂȘncia da doença; prevenir, consequentemente, as incapacidades e a doença em indivĂ­duos menores de 15 anos.

Revisores do Corpo Editorial do iH

Marcos TĂșlio Raposo e PatrĂ­cia D. Deps.

ReferĂȘncias

1. Scaliante De Moura R, Calado KL, Leide M, Oliveira W, BĂŒhrer-SĂ©kula S. Leprosy Serology Using PGL-I: A Systematic Review Sorologia Da HansenĂ­ase Utilizando PGL-I: RevisĂŁo SistemĂĄtica. Vol 41.; 2008.

2. Leturiondo AL, Noronha AB, Do Nascimento MOO, et al. Performance of serological tests PGL1 and NDO-LID in the diagnosis of leprosy in a reference Center in Brazil 11 Medical and Health Sciences 1103 Clinical Sciences. BMC Infect Dis. 2019;19(1). doi:10.1186/s12879-018-3653-0

3. Hooij A, Geluk A. In search of biomarkers for leprosy by unraveling the host immune response to Mycobacterium leprae. Immunol Rev. 2021;301(1):175-192. doi:10.1111/imr.12966

4. Tió-Coma M, KieƂbasa SM, van den Eeden SJF, et al. Blood RNA signature RISK4LEP predicts leprosy years before clinical onset. EBioMedicine. 2021;68:103379. doi:10.1016/j.ebiom.2021.103379

5. Santos AR, De Miranda AB, Sarno EN, Suffys PN, Degrave WM. Use of PCR-Mediated Amplification of Mycobacterium Leprae DNA in Different Types of Clinical Samples for the Diagnosis of Leprosy. Vol 39.; 1993.

6. Martinez AN, Britto CFPC, Nery JAC, et al. Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy. J Clin Microbiol. 2006;44(9). doi:10.1128/JCM.02250-05

7. Martinez AN, Ribeiro-Alves M, Sarno EN, Moraes MO. Evaluation of qPCR-Based assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5(10). doi:10.1371/journal.pntd.0001354

8. Barbieri RR, Manta FSN, Moreira SJM, et al. Quantitative polymerase chain reaction in paucibacillary leprosy diagnosis: A follow-up study. PLoS Negl Trop Dis. 2019;13(3). doi:10.1371/journal.pntd.0007147

9. Manta FSN, Barbieri RR, Moreira SJM, et al. Quantitative PCR for leprosy diagnosis and monitoring in household contacts: A follow-up study, 2011–2018. Sci Rep. 2019;9(1):16675. doi:10.1038/s41598-019-52640-5